[Nota cartacea] Ossidazione del campione mediante UV del rivelatore UV su HPLC-UV-MS
Trattato promemoria
Nell'analisi HPLC-UV-MS, è riportato che i raggi ultravioletti emessi dal rivelatore UV ossidano il campione e vengono rilevati sullo spettro MS come artefatti.
Letteratura target
Analisi HPLC-UV-MS: una fonte per gravi artefatti di ossidazione
Autore (Affiliazione): Fritz Schweikart e Gustaf Hulthe (AstraZeneca)
Rivista (data di pubblicazione): Analytical Chemistry (2019/01)
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b05845
Estratto originale
L'HPLC accoppiato sia a UV che a MS è una configurazione consolidata per le valutazioni della purezza in molte aree. Con la tecnologia in evoluzione, la sensibilità dello strumento aumenta, richiedendo una concentrazione del campione inferiore, mentre il flusso luminoso in una cella di rivelazione UV commerciale è considerevolmente più alto rispetto a prima. Questa evoluzione ha In questo lavoro mostriamo diversi esempi dallo sviluppo farmaceutico in cui la degradazione UV nel rivelatore UV porta a spettri di massa gravemente fuorvianti nei tipici campioni giornalieri.
(Traduzione completa)
Il sistema HPLC-UV-MS, che collega un rivelatore UV / Vis (spettroscopico ultravioletto-visibile) e uno spettrometro di massa (MS) alla cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), è ampiamente utilizzato in molti siti di analisi.Con l'innovazione tecnologica, è diventato possibile misurare e rilevare campioni con concentrazioni inferiori, mentre il flusso luminoso emesso dalla cella del rivelatore UV è anche più alto di prima.Di conseguenza, una quantità relativamente grande di radicali è stata generata dai raggi UV rispetto all'obiettivo dell'analisi e sono stati generati artefatti sullo spettro MS.In questo studio, prendendo come esempio lo sviluppo di farmaci, dimostriamo che l'ossidazione da parte dei rivelatori UV si traduce in uno spettro di massa fuorviante in campioni analitici quotidiani ordinari.
概要
【metodo】
Gli autori hanno dimostrato l'ossidazione del campione analitico durante la misurazione con un rivelatore UV utilizzando più di XNUMX campioni diversi.Gli obiettivi di misurazione includono amminoacidi, peptidi, proteine, acidi nucleici, composti a basso peso molecolare, ecc.
[Risultato]
L'effetto dei raggi UV era maggiore nelle aree a bassa concentrazione di campione nel percorso di erogazione del liquido.Certamente, il picco ossidante appare più fortemente nel punto iniziale (XNUMX) e nel punto finale (XNUMX) del picco che nella parte superiore del picco (XNUMX).Anche da +XNUMX a +XNUMX ossidanti vengono rilevati alla fine del picco.
Figura 1. Spettri di massa di Bombesin (Pyr-QRLG-NQWAVGHLM-NH2) nella frazione (1) iniziale, (2) principale e (3) tardiva del picco (sistema Agilent / Bruker). Lo spettro con la lampada UV spenta viene visualizzato come "no UV.".
TestoNella donazione, vengono misurati prodotti di decomposizione ossidativa noti e monoossidanti a triossidi (da +10 a +1) per vari campioni (Bombesin, Citocromo C, peptidi di circa 3 residui, Trp, Met, ketoprofene, ecc.). casi, ciascuno dei picchi di ossido 16-48 è stato rilevato con un'intensità relativa di circa il 1% di quella del picco invariato.
Inoltre, gli autori hanno dimostrato che la comparsa di tali picchi ossidanti può essere prevenuta in due modi:
① Spegnere la luce UV
② Aggiungere BHT durante la fase mobile
L'ossidazione del campione è stata osservata sia nel metanolo che nell'acetonitrile come solvente organico della fase B, ma sembra che l'acetonitrile abbia prodotto più ossidi.Inoltre, poiché la velocità del flusso è direttamente correlata al tempo di irradiazione, più veloce era, meno era ossidato.
Impressioni
Sapevo che era possibile che la luce UV del rilevatore UV / vis avrebbe causato l'ossidazione del campione, ma non pensavo che sarebbe stato davvero così lontano.
Il contenuto di questo documento rappresenta un problema quando si misurano sostanze sconosciute?Quando si misura una quantità molto piccola di metaboliti sconosciuti con la metabolomica, gli ossidanti vengono erroneamente conteggiati come sostanze diverse ed è probabile che la quantificazione relativa causi un errore.
La causa è la reazione con specie reattive dell'ossigeno (ROS: Reactive Oxygen Species) come i radicali idrossilici generati dagli UV e l'eccitazione di composti con una lunghezza d'onda di assorbimento prossima a 254 nm per decomposizione o fotodecomposizione indiretta.
Sembra che dovresti stare attento quando misuri campioni che sono facilmente ossidabili.In particolare amminoacidi come metionina (Met), triptofano (Trp), cisteina (Cys) e tirosina (Tyr), proteine peptidiche che li contengono e composti classificati come fotosensibilizzanti, cioè anelli aromatici e gruppi carbonilici. Composti con.
Bene, onestamente, non mi riferisco spesso allo spettro UV con fermezza nell'analisi della SM, quindi potrebbe essere una formica anche se è OFF.
In generale l'analisi quantitativa utilizzando LC-UV-MS, vengono utilizzate sostanze standard interne ed esterne, e queste dovrebbero essere ossidate allo stesso modo, quindi sento che non influenzano così tanto l'analisi (estrema). Ossidazione del campione a bassi livelli di concentrazione possono aumentare il limite inferiore di quantificazione ...).