【논문 메모】HPLC-UV-MS상 UV 검출기의 자외선에 의한 샘플의 산화
논문 메모
HPLC-UV-MS 분석에서, UV 검출기에서 나오는 자외선이 샘플을 산화시켜 버리고 artifact로서 MS 스펙트럼 상에 검출된다는 보고.
대상 문헌
HPLC–UV–MS Analysis: A Source for Severe Oxidation Artifacts
저자 (소속 기관): Fritz Schweikart and Gustaf Hulthe (아스트라제네카)
저널(발행년월): Analytical Chemistry (2019/01)
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b05845
원저 abstract
HPLC coupled to both UV and MS is an established setup for purity assessments in many areas. With evolving technology, instrument sensitivity increases, calling for lower sample concentration, while light flux in a commercial UV detector cell is considerablyegher now reached the point where radicals formed by UV light are abundant enough, compared to the analyte levels, to generate unwanted artifact signals in the MS spectrum. In this work we show several examples from pharmaceutical development where UV degradation in the UV misleading mass spectra in typical day to day samples.
(전역)
고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에, UV/Vis(자외 가시 분광) 검출기와 질량 분석계(MS)를 접속한 HPLC-UV-MS 시스템은, 많은 분석 현장에서 범용되고 있다.기술혁신에 따라 보다 저농도의 샘플도 측정·검출할 수 있게 된 한편, UV검출기 셀에 조사되는 광속도 이전보다 높아졌다.그 결과, 분석 대상에 비해 상대적으로 다량의 라디칼이 UV에 의해 생성되어 MS 스펙트럼 상에서 artifact를 생성할 정도로 되었다.본 연구는 의약품 개발을 예로 들어, UV 검출기에 의한 산화가 정상적인 일상 분석 샘플에서 오해를 초래하는 질량 스펙트럼을 초래한다는 것을 보여준다.
概要
【방법】
저자들은 XNUMX종류 이상의 시료를 이용하여 UV 검출기에 의한 측정 중 분석 시료의 산화를 실증하고 있습니다.측정 대상은 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산, 저분자 화합물 등…
【결과】
UV의 영향은 송액 경로의 샘플 농도가 낮은 부분에서 커졌다.확실히 피크 톱(XNUMX)에 비해 피크의 시작점(XNUMX)과 종료점(XNUMX)은 산화체 피크가 강하게 나타나고 있습니다.피크의 종료 부분에서는 +XNUMX~+XNUMX 산화체까지도 검출되고 있습니다.
Figure 1. Mass spectra of Bombesin (Pyr-QRLG-NQWAVGHLM-NH2) in the (1) early, (2) main, and (3) late eluting fraction of the peak (Agilent/Bruker system). For comparison, the MS spectrum with the UV lamp swit
글기여에서는 다양한 시료(Bombesin, Cytochrome C, 10잔기 정도의 펩티드, Trp, Met, ketoprofen 등)에 대해 알려진 산화분해물과 1산화체에서 3산화체(+16~+48)까지를 측정 그리고 1-50 산화체 피크 각각이 미변화체 피크에 대해 XNUMX% 정도의 상대 강도로 검출되고 있는 것도 있었습니다.
또한 저자들은 이러한 산화체 피크의 출현을 다음 두 가지 방법으로 방지할 수 있음을 보여줍니다.
① UV light를 OFF로 한다
② 이동상 중에 BHT를 가한다
시료의 산화는, B상의 유기 용매가 메탄올과 아세토니트릴의 어느쪽에서도 인정되지만, 아세토니트릴 쪽이 보다 산화체가 생성하고 있었던 것 같습니다.또한, 유속은 조사되는 시간에 직접 관련되기 때문에 빨리 산화되지 않았다.
소감
UV/vis 검출기의 자외선이 시료의 산화의 원인이 된다는 것은 가능성으로는 알고 있었습니다만, 실제로 여기까지는 생각하지 않았습니다.
본문헌의 내용이 문제가 되는 것은, 미지 물질의 측정시일까요?메타볼로믹스로 극미량의 미지 대사물의 측정시에는 실수로 산화체를 별물로서 카운트하거나 상대 정량으로는 오차의 원인이 될 것 같습니다.
원인은 UV에 의해 생성된 히드록시 라디칼 등의 활성 산소종(ROS: Reactive Oxygen Species)과의 반응이나, 254 nm 부근에 흡광 파장을 가지는 화합물이 여기하여 분해 or 간접 광분해하는 것에 의한 것이군요.
산화하기 쉬운 시료의 측정시는 조심하는 편 좋을 것 같네요.특히 메티오닌(Met)·트립토판(Trp)·시스테인(Cys)·티로신(Tyr) 등의 아미노산이나 이들을 포함하는 펩티드·단백질, 광증감 물질로 분류되는 화합물, 즉 방향환이나 카르보닐기 을 갖는 화합물 등.
뭐 정직 MS 분석으로 UV 스펙트럼을 확실히 참조하는 것이 별로 없기 때문에, 차라리 OFF에서도 개미일지도…
LC-UV-MS를 이용한 일반적인 정량분석에서는 내부·외부 표준물질을 이용하고 있어 이들도 마찬가지로 산화될 것이므로 분석에는 그다지 영향을 주지 않는 것 같다(극 저농도 레벨에서 샘플이 산화되면 정량 하한 레벨이 올라 버릴지도 모릅니다만…).