[Papiernotiz] Oxidation der Probe durch UV des UV-Detektors auf HPLC-UV-MS
Abhandlung Memo
Bei der HPLC-UV-MS-Analyse wird berichtet, dass die vom UV-Detektor emittierten ultravioletten Strahlen die Probe oxidieren und im MS-Spektrum als Artefakte nachgewiesen werden.
Zielliteratur
HPLC-UV-MS-Analyse: Eine Quelle für schwere Oxidationsartefakte
Autor (Zugehörigkeit): Fritz Schweikart und Gustaf Hulthe (AstraZeneca)
Zeitschrift (Erscheinungsdatum): Analytical Chemistry (2019/01)
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b05845
Ursprüngliche Zusammenfassung
Die an UV und MS gekoppelte HPLC ist in vielen Bereichen ein etablierter Ansatz für Reinheitsbewertungen. Mit der sich entwickelnden Technologie steigt die Empfindlichkeit des Instruments und erfordert eine niedrigere Probenkonzentration, während der Lichtfluss in einer kommerziellen UV-Detektorzelle erheblich höher ist als früher In dieser Arbeit zeigen wir einige Beispiele aus der pharmazeutischen Entwicklung, bei denen der UV-Abbau im UV-Detektor in typischen Alltagsproben zu stark irreführenden Massenspektren führt.
(Vollständige Übersetzung)
Das HPLC-UV-MS-System, das einen UV / Vis-Detektor (UV-Spektroskopie) und ein Massenspektrometer (MS) mit der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) verbindet, ist an vielen Analysestellen weit verbreitet.Mit technologischer Innovation ist es möglich geworden, Proben mit niedrigeren Konzentrationen zu messen und zu erfassen, während der an die UV-Detektorzelle emittierte Lichtstrom ebenfalls höher ist als zuvor.Infolgedessen wurde im Vergleich zum Analyseziel eine relativ große Menge an Radikalen durch UV erzeugt, und Artefakte wurden im MS-Spektrum erzeugt.In dieser Studie am Beispiel der Arzneimittelentwicklung zeigen wir, dass die Oxidation durch UV-Detektoren in gewöhnlichen täglichen analytischen Proben zu einem irreführenden Massenspektrum führt.
概要
【Methode】
Die Autoren haben die Oxidation der analytischen Probe während der Messung mit einem UV-Detektor unter Verwendung von mehr als XNUMX verschiedenen Proben nachgewiesen.Messziele umfassen Aminosäuren, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, niedermolekulare Verbindungen usw.
[Ergebnis]
Die Wirkung von UV war in Bereichen mit geringer Probenkonzentration auf dem Flüssigkeitsabgabeweg größer.Sicherlich erscheint der Oxidationsmittelpeak am Startpunkt (XNUMX) und am Endpunkt (XNUMX) des Peaks stärker als am Peakoberteil (XNUMX).Am Ende des Peaks werden sogar +XNUMX bis +XNUMX Oxidationsmittel nachgewiesen.
Figure 1. Massenspektren von Bombesin (Pyr-QRLG-NQWAVGHLM-NH2) in der (1) frühen, (2) Haupt- und (3) spät eluierenden Fraktion des Peaks (Agilent / Bruker-System). Zum Vergleich die MS Das Spektrum bei ausgeschalteter UV-Lampe wird als „kein UV“ angezeigt.
TextBei der Spende werden bekannte oxidative Zersetzungsprodukte und Monooxidationsmittel zu Trioxiden (+10 bis +1) für verschiedene Proben gemessen (Bombesin, Cytochrom C, Peptide mit etwa 3 Resten, Trp, Met, Ketoprofen usw.) In diesen Fällen wurde jeder der 16-48 Oxidpeaks mit einer relativen Intensität von etwa 1% derjenigen des unveränderten Peaks nachgewiesen.
Darüber hinaus haben die Autoren gezeigt, dass das Auftreten solcher Oxidationsmittelpeaks auf zwei Arten verhindert werden kann:
① Schalten Sie das UV-Licht aus
② Fügen Sie BHT während der mobilen Phase hinzu
Eine Oxidation der Probe wird sowohl in Methanol als auch in Acetonitril als organischem Lösungsmittel der Phase B beobachtet, aber es scheint, dass Acetonitril mehr Oxidationsmittel produzierte.Da die Strömungsgeschwindigkeit in direktem Zusammenhang mit der Bestrahlungszeit steht, war sie umso weniger oxidiert, je schneller sie war.
Impressionen
Ich wusste, dass es möglich ist, dass das UV-Licht des UV / Vis-Detektors eine Oxidation der Probe verursacht, aber ich dachte nicht, dass es tatsächlich so weit sein würde.
Ist der Inhalt dieses Dokuments ein Problem bei der Messung unbekannter Substanzen?Bei der Messung einer sehr kleinen Menge unbekannter Metaboliten mit Metabolomics werden Oxidationsmittel fälschlicherweise als unterschiedliche Substanzen gezählt, und eine relative Quantifizierung führt wahrscheinlich zu einem Fehler.
Die Ursache ist die Reaktion mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS: Reactive Oxygen Species) wie durch UV erzeugten Hydroxylradikalen und die Anregung von Verbindungen mit einer Absorptionswellenlänge nahe 254 nm zur Zersetzung oder indirekten Photozersetzung.
Es scheint, dass Sie vorsichtig sein sollten, wenn Sie Proben messen, die leicht oxidieren.Insbesondere Aminosäuren wie Methionin (Met), Tryptophan (Trp), Cystein (Cys) und Tyrosin (Tyr), Peptidproteine, die diese enthalten, und Verbindungen, die als Photosensibilisatoren klassifiziert sind, dh aromatische Ringe und Carbonylgruppen. Verbindungen mit.
Ehrlich gesagt beziehe ich mich in der MS-Analyse nicht oft fest auf das UV-Spektrum, daher kann es eine Ameise sein, selbst wenn es ausgeschaltet ist.
Bei der allgemeinen quantitativen Analyse mit LC-UV-MS werden interne und externe Standardsubstanzen verwendet, die auf die gleiche Weise oxidiert werden sollten, sodass ich der Meinung bin, dass sie die Analyse nicht so stark beeinflussen (extrem). Oxidation der Probe bei Niedrige Konzentrationen können die untere Bestimmungsgrenze erhöhen ...).