[Paper memo] Oksidasi sampel oleh sinar ultraviolet dari detektor UV pada HPLC-UV-MS
memo kertas
Dalam analisis HPLC-UV-MS, sinar ultraviolet yang dipancarkan dari detektor UV mengoksidasi sampel, yang terdeteksi sebagai artefak pada spektrum MS.
Literatur sasaran
Analisis HPLC–UV–MS: Sumber Artefak Oksidasi Parah
Penulis (Afiliasi): Fritz Schweikart dan Gustaf Hulthe (AstraZeneca)
Jurnal (Tanggal Publikasi): Kimia Analitik (2019/01)
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b05845
abstrak asli
HPLC yang dipadukan dengan UV dan MS adalah pengaturan yang mapan untuk penilaian kemurnian di banyak area. Dengan teknologi yang berkembang, sensitivitas instrumen meningkat, membutuhkan konsentrasi sampel yang lebih rendah, sementara fluks cahaya dalam sel detektor UV komersial jauh lebih tinggi daripada sebelumnya. sekarang mencapai titik di mana radikal yang dibentuk oleh sinar UV cukup melimpah, dibandingkan dengan tingkat analit, untuk menghasilkan sinyal artefak yang tidak diinginkan dalam spektrum MS. Dalam karya ini kami menunjukkan beberapa contoh dari pengembangan farmasi di mana degradasi UV pada detektor UV menyebabkan spektrum massa yang sangat menyesatkan dalam sampel sehari-hari yang khas.
(terjemahan penuh)
Sistem HPLC-UV-MS, yang merupakan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) yang terhubung ke detektor UV/Vis (ultraviolet-visible spectroscopy) dan spektrometer massa (MS), banyak digunakan di banyak bidang analitik.Inovasi teknologi telah memungkinkan untuk mengukur dan mendeteksi sampel dengan konsentrasi lebih rendah, sedangkan fluks bercahaya yang mengenai sel detektor UV lebih tinggi dari sebelumnya.Akibatnya, jumlah radikal yang dihasilkan oleh UV relatif besar dibandingkan dengan target analisis, dan menjadi cukup untuk menghasilkan artefak pada spektrum MS.Dalam penelitian ini, kami menggunakan contoh pengembangan obat untuk menunjukkan bahwa oksidasi yang terdeteksi UV menyebabkan spektrum massa yang menyesatkan dalam sampel analitik rutin sehari-hari.
概要
【metode】
Penulis menggunakan lebih dari XNUMX sampel untuk mendemonstrasikan oksidasi analit selama pengukuran dengan detektor UV.Target pengukuran meliputi asam amino, peptida, protein, asam nukleat, dan senyawa dengan berat molekul rendah.
【hasil】
Efek UV lebih besar di area rute transfer cairan dimana konsentrasi sampel rendah.Memang dibandingkan dengan puncak puncak (XNUMX), puncak oksidan tampak lebih kuat pada puncak titik awal (XNUMX) dan titik akhir (XNUMX).+XNUMX sampai +XNUMX oksidan juga terdeteksi pada akhir puncak.
Gambar 1. Spektrum massa Bombesin (Pyr-QRLG-NQWAVGHLM-NH2) pada spektrum (1) awal, (2) utama, dan (3) fraksi elusi akhir puncak (sistem Agilent/Bruker) dengan lampu UV dimatikan ditampilkan sebagai "tidak ada UV.".
文Untuk berbagai sampel (Bombesin, Sitokrom C, peptida dengan sekitar 10 residu, Trp, Met, ketoprofen, dll.), produk degradasi oksidatif yang diketahui dan 1-oksidan menjadi 3-oksidan (+16 hingga +48) diukur. beberapa kasus, 1-50 puncak teroksidasi masing-masing terdeteksi pada intensitas relatif sekitar XNUMX% dari puncak yang tidak berubah.
Selanjutnya, penulis menunjukkan bahwa munculnya puncak oksidan tersebut dapat dicegah dengan dua cara.
① Matikan lampu UV
② Tambahkan BHT ke fase gerak
Oksidasi sampel diamati pada kedua pelarut organik fase B, metanol dan asetonitril, tetapi asetonitril tampaknya menghasilkan lebih banyak oksidan.Selain itu, karena laju alir berhubungan langsung dengan waktu penyinaran, semakin cepat laju alir, semakin sedikit teroksidasi.
kesan
Saya tahu ada kemungkinan bahwa sinar ultraviolet dari detektor UV/vis akan menyebabkan sampel teroksidasi, tetapi saya tidak berpikir itu akan sampai sejauh ini.
Apakah isi dokumen ini menjadi masalah saat mengukur zat yang tidak diketahui?Saat mengukur sejumlah kecil metabolit yang tidak diketahui dalam metabolisme, oksidan mungkin salah dihitung sebagai zat yang berbeda, dan kuantifikasi relatif dapat menyebabkan kesalahan.
Penyebabnya adalah reaksi dengan spesies oksigen reaktif (ROS: Reactive Oxygen Species) seperti radikal hidroksil yang dihasilkan oleh UV, dan dekomposisi atau fotolisis tidak langsung akibat eksitasi senyawa dengan panjang gelombang serapan sekitar 254 nm.
Tampaknya lebih baik berhati-hati saat mengukur sampel yang mudah teroksidasi.Secara khusus, asam amino seperti metionin (Met), triptofan (Trp), sistein (Cys), dan tirosin (Tyr), peptida dan protein yang mengandung ini, dan senyawa yang diklasifikasikan sebagai fotosensitizer, yaitu cincin aromatik dan gugus karbonil seperti senyawa dengan
Sejujurnya, saya tidak sering mengacu pada spektrum UV dengan benar dalam analisis MS, jadi mungkin lebih baik mematikannya.
Secara umum analisis kuantitatif menggunakan LC-UV-MS, standar internal dan eksternal digunakan, dan ini harus dioksidasi dengan cara yang sama, jadi menurut saya ini tidak akan banyak mempengaruhi analisis (sangat jika sampel dioksidasi pada konsentrasi rendah tingkat, batas bawah kuantisasi dapat meningkat ...).