[Papieren memo] Oxidatie van monster door UV of UV-detector op HPLC-UV-MS
Verhandeling memo
Bij HPLC-UV-MS-analyse wordt gemeld dat de ultraviolette straling die door de UV-detector wordt uitgezonden, het monster oxideert en als artefacten op het MS-spectrum wordt gedetecteerd.
Target literatuur
HPLC-UV-MS-analyse: een bron voor ernstige oxidatieartefacten
Auteur (affiliatie): Fritz Schweikart en Gustaf Hulthe (AstraZeneca)
Tijdschrift (publicatiedatum): Analytical Chemistry (2019/01)
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b05845
Origineel abstract
HPLC gekoppeld aan zowel UV als MS is een gevestigde opzet voor zuiverheidsbeoordelingen op veel gebieden. Met de zich ontwikkelende technologie neemt de gevoeligheid van het instrument toe, wat een lagere monsterconcentratie vereist, terwijl de lichtstroom in een commerciële UV-detectorcel aanzienlijk hoger is dan voorheen. In dit werk laten we verschillende voorbeelden zien uit de farmaceutische ontwikkeling waar UV-afbraak in de UV-detector leidt tot ernstig misleidende massaspectra in typische dagelijkse monsters.
(Volledige vertaling)
Het HPLC-UV-MS-systeem, dat een UV / Vis (ultraviolet-zichtbare spectroscopische) detector en een massaspectrometer (MS) verbindt met hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC), wordt veel gebruikt in veel analyse-sites.Met technologische innovatie is het mogelijk geworden om monsters met lagere concentraties te meten en te detecteren, terwijl de lichtstroom die naar de UV-detectorcel wordt uitgezonden ook hoger is dan voorheen.Als resultaat werd een relatief grote hoeveelheid radicalen gegenereerd door UV in vergelijking met het analysedoel, en werden artefacten gegenereerd op het MS-spectrum.In deze studie, waarbij we de ontwikkeling van geneesmiddelen als voorbeeld nemen, laten we zien dat oxidatie door UV-detectoren resulteert in een misleidend massaspectrum in gewone dagelijkse analytische monsters.
概要
【methode】
De auteurs hebben oxidatie van het analytische monster aangetoond tijdens metingen met een UV-detector met behulp van meer dan XNUMX verschillende monsters.Meetdoelen zijn onder meer aminozuren, peptiden, eiwitten, nucleïnezuren, verbindingen met een laag molecuulgewicht, enz.
【resultaat】
Het effect van UV was groter in gebieden met een lage monsterconcentratie in de vloeibare toedieningsroute.Zeker, de oxidatiemiddelpiek verschijnt sterker bij het beginpunt (XNUMX) en eindpunt (XNUMX) van de piek dan bij de piektop (XNUMX).Zelfs +XNUMX tot +XNUMX oxidanten worden aan het einde van de piek gedetecteerd.
Figuur 1. Massaspectra van Bombesin (Pyr-QRLG-NQWAVGHLM-NH2) in de (1) vroege, (2) hoofd- en (3) laat eluerende fractie van de piek (Agilent / Bruker-systeem). spectrum met de UV-lamp uitgeschakeld wordt weergegeven als "geen UV.".
文Bij de donatie worden bekende oxidatieve afbraakproducten en mono-oxidanten tot trioxiden (+10 tot +1) gemeten voor verschillende monsters (Bombesin, Cytochroom C, peptiden van ongeveer 3 residuen, Trp, Met, ketoprofen, enz.). In gevallen werd elk van de 16-48 oxidepieken gedetecteerd met een relatieve intensiteit van ongeveer 1% van die van de onveranderde piek.
Bovendien hebben de auteurs aangetoond dat het optreden van dergelijke oxidatiemiddelpieken op twee manieren kan worden voorkomen:
① Schakel UV-licht uit
② BHT toevoegen tijdens de mobiele fase
Oxidatie van het monster wordt waargenomen in zowel methanol als acetonitril als het organische oplosmiddel van fase B, maar het lijkt erop dat acetonitril meer oxidatiemiddelen produceerde.Omdat de stroomsnelheid direct gerelateerd is aan de bestralingstijd, hoe sneller het was, hoe minder geoxideerd het was.
Indrukken
Ik wist dat het mogelijk was dat het UV-licht van de UV / vis-detector oxidatie van het monster zou veroorzaken, maar ik dacht niet dat het zo ver zou zijn.
Is de inhoud van dit document een probleem bij het meten van onbekende stoffen?Bij het meten van een zeer kleine hoeveelheid onbekende metabolieten met metabolomics, worden oxidantia ten onrechte als verschillende stoffen geteld, en relatieve kwantificering zal waarschijnlijk een fout veroorzaken.
De oorzaak is de reactie met reactieve zuurstofsoorten (ROS: Reactive Oxygen Species) zoals hydroxylradicalen gegenereerd door UV, en de excitatie van verbindingen met een absorptiegolflengte nabij 254 nm voor ontleding of indirecte foto-ontleding.
Het lijkt erop dat u voorzichtig moet zijn bij het meten van monsters die gemakkelijk worden geoxideerd.In het bijzonder aminozuren zoals methionine (Met), tryptofaan (Trp), cysteïne (Cys) en tyrosine (Tyr), peptide-eiwitten die deze bevatten, en verbindingen die zijn geclassificeerd als fotosensibilisatoren, dat wil zeggen aromatische ringen en carbonylgroepen. Verbindingen met.
Eerlijk gezegd verwijs ik niet vaak naar het UV-spectrum in MS-analyse, dus het kan een mier zijn, zelfs als het UIT staat.
In het algemeen worden kwantitatieve analyse met behulp van LC-UV-MS, interne en externe standaard stoffen gebruikt, en deze zouden op dezelfde manier geoxideerd moeten worden, dus ik denk dat ze de analyse niet zozeer beïnvloeden (extreem). Oxidatie van het monster bij lage concentratieniveaus kunnen de ondergrens van kwantificering verhogen ...).