[Note papier] Oxydation de l'échantillon par UV du détecteur UV sur HPLC-UV-MS
Mémo de traité
Dans l'analyse HPLC-UV-MS, il est rapporté que les rayons ultraviolets émis par le détecteur UV oxydent l'échantillon et sont détectés sur le spectre MS comme des artefacts.
Littérature cible
Analyse HPLC – UV – MS: une source d'artefacts d'oxydation sévère
Auteur (Affiliation): Fritz Schweikart et Gustaf Hulthe (AstraZeneca)
Journal (date de publication): Analytical Chemistry (2019/01)
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b05845
Résumé original
La HPLC couplée à la fois aux UV et à la MS est une configuration établie pour les évaluations de pureté dans de nombreux domaines. Avec l'évolution de la technologie, la sensibilité de l'instrument augmente, ce qui nécessite une concentration d'échantillon plus faible, tandis que le flux lumineux dans une cellule de détection UV commerciale est considérablement plus Dans ce travail, nous montrons plusieurs exemples de développement pharmaceutique où la dégradation UV dans le détecteur UV conduit à des spectres de masse très trompeurs dans des échantillons quotidiens typiques.
(Traduction complète)
Le système HPLC-UV-MS, qui relie un détecteur UV / Vis (ultraviolet-visible spectroscopic) et un spectromètre de masse (MS) à la chromatographie liquide haute performance (HPLC), est largement utilisé dans de nombreux sites d'analyse.Grâce à l'innovation technologique, il est devenu possible de mesurer et de détecter des échantillons avec des concentrations plus faibles, tandis que le flux lumineux émis vers la cellule du détecteur UV est également plus élevé qu'auparavant.En conséquence, une quantité relativement importante de radicaux a été générée par UV par rapport à la cible d'analyse, et des artefacts ont été générés sur le spectre MS.Dans cette étude, en prenant le développement de médicaments comme exemple, nous montrons que l'oxydation par les détecteurs UV se traduit par un spectre de masse trompeur dans des échantillons analytiques quotidiens ordinaires.
概要
【méthode】
Les auteurs ont mis en évidence l'oxydation de l'échantillon analytique lors de la mesure avec un détecteur UV en utilisant plus de XNUMX échantillons différents.Les cibles de mesure comprennent les acides aminés, les peptides, les protéines, les acides nucléiques, les composés de faible poids moléculaire, etc.
[Résultat]
L'effet des UV était plus important dans les zones de faible concentration d'échantillon dans la voie de distribution de liquide.Certes, le pic oxydant apparaît plus fortement au point de départ (XNUMX) et au point final (XNUMX) du pic qu'au sommet du pic (XNUMX).Même +XNUMX à +XNUMX oxydants sont détectés à la fin du pic.
Figure 1. Spectres de masse de la bombésine (Pyr-QRLG-NQWAVGHLM-NH2) dans la fraction d'élution (1) précoce, (2) principale et (3) tardive du pic (système Agilent / Bruker). le spectre avec la lampe UV éteinte est indiqué comme «pas d'UV».
文Lors du don, les produits de décomposition oxydants connus et les monooxydants en trioxydes (+10 à +1) sont mesurés pour divers échantillons (Bombésine, Cytochrome C, peptides d'environ 3 résidus, Trp, Met, kétoprofène, etc.). cas, chacun des 16 à 48 pics d'oxyde a été détecté avec une intensité relative d'environ 1% par rapport au pic de forme inchangée.
De plus, les auteurs ont montré que l'apparition de tels pics oxydants peut être prévenue de deux manières:
① Éteignez la lumière UV
② Ajouter du BHT pendant la phase mobile
L'oxydation de l'échantillon est observée à la fois dans le méthanol et l'acétonitrile en tant que solvant organique de la phase B, mais il semble que l'acétonitrile produise plus d'oxydes.De plus, comme la vitesse d'écoulement est directement liée au temps d'irradiation, plus elle était rapide, moins elle était oxydée.
Impressions
Je savais qu'il était possible que la lumière UV du détecteur UV / vis provoque l'oxydation de l'échantillon, mais je ne pensais pas que ce serait en fait aussi loin.
Le contenu de ce document pose-t-il un problème lors de la mesure de substances inconnues?Lors de la mesure d'une très petite quantité de métabolites inconnus avec métabolomique, les oxydants sont comptés à tort comme des substances différentes, et la quantification relative est susceptible de provoquer une erreur.
La cause est la réaction avec les espèces réactives de l'oxygène (ROS: Reactive Oxygen Species) telles que les radicaux hydroxyles générés par les UV, et l'excitation de composés avec une longueur d'onde d'absorption proche de 254 nm pour décomposition ou photodécomposition indirecte.
Il semble que vous devez être prudent lorsque vous mesurez des échantillons facilement oxydables.En particulier, les acides aminés tels que la méthionine (Met), le tryptophane (Trp), la cystéine (Cys) et la tyrosine (Tyr), les protéines peptidiques les contenant et les composés classés comme photosensibilisateurs, c'est-à-dire les cycles aromatiques et les groupes carbonyle. Composé avec.
Eh bien, honnêtement, je ne me réfère pas souvent fermement au spectre UV dans l'analyse de la SEP, il peut donc s'agir d'une fourmi même si elle est désactivée.
Dans l'analyse quantitative générale utilisant LC-UV-MS, des substances standard internes et externes sont utilisées, et celles-ci doivent être oxydées de la même manière, je pense donc qu'elles n'affectent pas autant l'analyse (extrême). Oxydation de l'échantillon à de faibles niveaux de concentration peuvent élever la limite inférieure de quantification ...).