[Paper memo] Oxidação da amostra por UV do detector de UV em HPLC-UV-MS
Memorando de tratado
Na análise HPLC-UV-MS, é relatado que os raios ultravioleta emitidos pelo detector de UV oxidam a amostra e são detectados no espectro MS como artefatos.
Literatura alvo
Análise HPLC-UV-MS: Uma fonte para artefatos de oxidação severa
Autor (afiliação): Fritz Schweikart e Gustaf Hulthe (AstraZeneca)
Jornal (data publicada): Química Analítica (2019/01)
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b05845
Resumo original
HPLC acoplado a UV e MS é uma configuração estabelecida para avaliações de pureza em muitas áreas. Com a evolução da tecnologia, a sensibilidade do instrumento aumenta, exigindo menor concentração de amostra, enquanto o fluxo de luz em uma célula detectora de UV comercial é consideravelmente maior do que antes. Neste trabalho, mostramos vários exemplos de desenvolvimento farmacêutico onde a degradação de UV no detector de UV leva a espectros de massa extremamente enganosos em amostras típicas do dia a dia.
(Tradução completa)
O sistema HPLC-UV-MS, que conecta um detector de UV / Vis (espectroscópico ultravioleta-visível) e um espectrômetro de massa (MS) à cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), é amplamente utilizado em muitos locais de análise.Com a inovação tecnológica, tornou-se possível medir e detectar amostras com concentrações mais baixas, enquanto o fluxo luminoso emitido para a célula detectora de UV também é maior do que antes.Como resultado, uma quantidade relativamente grande de radicais foi gerada por UV em comparação com o alvo de análise e artefatos foram gerados no espectro de MS.Neste estudo, tomando o desenvolvimento de drogas como exemplo, mostramos que a oxidação por detectores de UV resulta em um espectro de massa enganoso em amostras analíticas diárias comuns.
概要
【método】
Os autores demonstraram a oxidação da amostra analítica durante a medição com um detector de UV usando mais de XNUMX amostras diferentes.Os alvos de medição incluem aminoácidos, peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos, compostos de baixo peso molecular, etc.
【Resultados】
O efeito do UV foi maior em áreas de baixa concentração de amostra na rota de distribuição de líquido.Certamente, o pico do oxidante aparece mais fortemente no ponto inicial (XNUMX) e no ponto final (XNUMX) do pico do que no topo do pico (XNUMX).Mesmo +XNUMX a +XNUMX oxidantes são detectados no final do pico.
Figura 1. Espectro de massa de Bombesina (Pyr-QRLG-NQWAVGHLM-NH2) na (1) fração de eluição inicial, (2) principal e (3) tardia do pico (sistema Agilent / Bruker). Para comparação, o MS espectro com a lâmpada UV desligada é mostrado como “sem UV.”.
TextNa doação, produtos de decomposição oxidativa conhecidos e monooxidantes em trióxidos (+10 a +1) são medidos para várias amostras (Bombesina, Citocromo C, peptídeos de cerca de 3 resíduos, Trp, Met, cetoprofeno, etc.). No entanto, em alguns casos, cada um dos 16-48 picos de óxido foi detectado com uma intensidade relativa de cerca de 1% daquela do pico inalterado.
Além disso, os autores mostraram que o aparecimento de tais picos oxidantes pode ser evitado de duas maneiras:
① Desligue a luz UV
② Adicionar BHT durante a fase móvel
A oxidação da amostra é observada em metanol e acetonitrila como solvente orgânico da fase B, mas parece que a acetonitrila produziu mais óxidos.Além disso, como a velocidade do fluxo está diretamente relacionada ao tempo de irradiação, quanto mais rápido, menos oxidado fica.
Impressões
Eu sabia que era possível que a luz ultravioleta do detector ultravioleta pudesse causar a oxidação da amostra, mas não pensei que fosse realmente tão longe.
O conteúdo deste documento é um problema ao medir substâncias desconhecidas?Ao medir uma quantidade muito pequena de metabólitos desconhecidos com metabolômica, os oxidantes são erroneamente contados como substâncias diferentes, e a quantificação relativa provavelmente causará um erro.
A causa é a reação com espécies reativas de oxigênio (ROS: Reactive Oxygen Species), como radicais hidroxila gerados por UV, e a excitação de compostos com comprimento de onda de absorção próximo a 254 nm para decomposição ou fotodecomposição indireta.
Parece que você deve ter cuidado ao medir amostras que são facilmente oxidadas.Em particular, aminoácidos como metionina (Met), triptofano (Trp), cisteína (Cys) e tirosina (Tyr), proteínas peptídicas que os contêm e compostos classificados como fotossensibilizadores, ou seja, anéis aromáticos e grupos carbonil. Compostos com.
Bem, honestamente, não costumo referir-me firmemente ao espectro UV na análise de MS, então pode ser uma formiga, mesmo se estiver DESLIGADO.
Na análise quantitativa geral usando LC-UV-MS, são utilizadas substâncias de padrão interno e externo, e estas devem ser oxidadas da mesma forma, por isso sinto que não afetam tanto a análise (extremo). Oxidação da amostra em baixos níveis de concentração podem aumentar o limite inferior de quantificação ...).